在之前的两篇文章中，我们分别讨论了《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者》和《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者（二）》，介绍了FRET技术的基本原理、实验步骤以及应用场景。本期内容将由EVO视讯为您解析FRET技术中常用的分析方法。

在FRET技术中，FRET效率的定量检测主要受到两个因素的影响：（1）光谱串扰，包括供体荧光在受体通道的干扰及直接激发受体的情况。选择荧光对时，应优先考虑发射光谱差异较大的供体与受体，以降低光谱串扰的影响；（2）供体与受体在荧光基团中的比例。并非所有的分子都参与FRET作用，因此各种方法测定的FRET效率只能反映表观效率。

当前应用较广泛的FRET分析方法主要有荧光寿命成像（FLIM）、光谱法（sFRET）、受体光漂白法（AP-FRET）及敏化发射法（SE-FRET）。接下来，将逐一介绍这些分析方法。

荧光寿命成像（FLIM）

荧光寿命成像法（FLIM-FRET）是通过测量荧光基团从激发态到基态的平均时间，即荧光寿命来分析FRET效率。这种方法对实验条件如样品浓度和光漂白不敏感，但对微环境的变化非常敏感，因此能够有效反映供体和受体之间的相互作用。

在实际操作中，FLIM通过测量供体在受体存在与否时的荧光寿命，来计算FRET效率。但FLIM设备价格昂贵且操作复杂，限制了其应用。

光谱法（sFRET）

每种荧光团都有特定的激发和发射光谱。光谱法通过获取供体、受体及其复合体的发射光谱，并进行拟合分析，计算出FRET效率。这种方法在灵敏度方面表现出色，能够检测低于5%的FRET信号。然而，sFRET对数据采集要求较高，需准确校正背景光和自发荧光，增加了实验的复杂性。

受体光漂白法（AP-FRET）

受体光漂白法（AP-FRET）的原理是当FRET发生时，供体的荧光强度因能量转移而减弱；对受体进行光漂白后，FRET消失，供体荧光强度增加。该方法简单易行，对设备要求不高，常用的普通共聚焦显微镜即可进行。但是，活细胞的荧光光漂白恢复特性限制了AP-FRET在实时动态监测中的应用。

敏化发射法（SE-FRET）

敏化发射法（SE-FRET）通过校正供体与受体之间的光谱重叠，获取FRET图像并计算效率。此法需要设置标准样本以获得校正因子G，可有效监测活细胞中的动态交互。但该方法需多组样本进行图像采集，并在确定校正因子后不允许更改系统参数，这增加了实验的复杂度和工作量。

综上所述，EVO视讯为大家介绍了当前常用的四种FRET分析方法。不同的分析方法在灵敏度、适用性及操作复杂度上各有特点，应用者可根据具体实验需求和硬件设施选择合适的方案。如需更深入的讨论，欢迎与EVO视讯进行交流。