在之前的两篇文章《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者》和《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者（二）》中，我们分别介绍了FRET的技术原理、实验步骤以及应用实例。本期，EVO视讯将带领大家深入了解FRET技术的常用分析方法。

在FRET技术中，FRET效率定量检测的主要影响因素有两个：(1) 光谱串扰，包括供体荧光串扰到受体通道以及激发供体时对受体的直接激发。在选择FRET实验的荧光对时，应选择发射光谱分离较大的供受体荧光对，以降低光谱串扰的影响；(2) 供体和受体在荧光基团中的比例。由于自由的供体和受体之间的相互作用并非所有分子都参与其中，因此各种方法对FRET效率的计算只能测量表观的FRET效率。

目前，常用的FRET分析方法主要包括荧光寿命成像、光谱法、受体光漂白法以及敏化发射法，接下来将逐一介绍这些常用的分析技术。

荧光寿命成像法

荧光寿命成像法（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM-FRET）主要通过测量荧光基团从激发态恢复到基态的平均时间（即荧光寿命）来分析FRET效率。荧光寿命作为荧光基团的固有属性，与样品的浓度和光漂白等因素无关，但对周围的微环境（如温度、pH值、离子浓度及分子结合等）非常敏感，因此能够有效反映激发态分子与微环境的相互作用及能量转移，用于分析供体与受体之间的FRET效率。

光谱法

光谱法FRET（spectral FRET, sFRET）则通过获取供体样本、受体样本及供体-受体样本的发射光谱进行分析。这一方法通过对比供体和受体的样本光谱来拟合分析供体-受体样本的光谱，以获得FRET效率。sFRET是目前最为灵敏的FRET效率测量方法，能够检测到低于5%的FRET信号。该技术有效去除了背景光和自发荧光的干扰，同时解决了光谱串扰问题。

受体漂白法

受体漂白法（Acceptor Photobleaching, AP-FRET）在FRET存在的情况下，供体的荧光强度会因能量部分转移给受体而降低；而当对受体进行光漂白后，失去FRET效果会使供体的荧光强度增加。这种方法通过比对受体漂白前后供体的荧光强度来计算FRET效率。AP-FRET操作简单，适用于普通共聚焦显微镜，使得其应用范围广泛。

敏化发射法

敏化发射法（Sensitized Emission, SE-FRET）通过校正供体和受体之间的光谱渗透来获取FRET图像并计算FRET效率。此方法需要包括供体和受体的样本，以及已知FRET效率的校准样本。SE-FRET强调在动态监测活细胞中的FRET效率，因此虽然操作需要较多样本，但不会对细胞造成损伤。

综上所述，EVO视讯为大家介绍了四种常用的FRET分析方法。研究者们可以根据实验需求和设备条件选择最合适的分析方式。如需进一步讨论，欢迎咨询EVO视讯与我们沟通。